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培養基的製備、使用、保存及相關疑難解答

時間:2019-06-19

正確製備培養基時微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分,尤其是含有有毒物質(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規範和生產廠商提供的使用說明。培養基的不正確製備會導致培養基出現質量問題。


使用商品化脫水合成培養基製備培養基時,應嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關數據,如質量/體積、pH、製備日期、滅菌條件和製備人員等。


使用各別成分製備培養基時,應按照配方準確配製,記錄所有細節信息,如;培養基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質含量、製造商、批號、pH、培養基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。


1.水

除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高於25uS/cm(相當於電阻率≥0.4MΩcm)。


微生物汙染應不超過103CFU/mL,最好低於102CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的汙染。


2.稱量和複水

稱量所需量的脫水培養基(注意防止吸入粉末,尤其是含有有害物質的培養基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養基結塊)後再加水至所需的量。


3.溶解和分裝

脫水培養基加水後適當加熱,並不攪拌使其快速溶解,必要時,重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鍾。


4.pH的測定和調整

用pH計測定pH,必要時在滅菌前調節pH,除特殊說明外,培養基滅菌後冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌後調節pH,溶液需滅菌。

注:商品化培養基在高壓滅菌前後pH可能發生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調節pH。


5.分裝

將配置好的培養基分裝到適當的容器中,容器的體積至少為體積的1.2倍。


6.滅菌

①概述

培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。

有些培養基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如,含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感,應在煮沸後快速冷卻,避光保存。同樣,一些試劑則不需要滅菌,直接使用(參見相關標準或生產廠商的使用說明)。


②濕熱滅菌

濕熱滅菌在高壓鍋或培養基製備器中進行。高壓黴菌一般采用121℃±3℃黴菌15min。如果培養基的體積超過1000mL,要對滅菌條件進行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說明的規定進行。

注:大容量培養基(>1000mL)滅菌時可能會造成過度加熱。

加熱後應采取適當的方式冷卻,防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基(如含亮綠的培養基)是非常重要的。


③過濾滅菌

過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。

一些濾膜上附著蛋白質或其他物質(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。


④監測

應對經濕熱或過濾滅菌的培養基進行監測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監測。


7.添加劑的製備

製備含有有毒物質(特別是抗生素)時應小心操作,避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發生其他不良反應。采用適當的預防措施並小心按照產品使用說明操作。不要使用過期的試劑;抗生素工作溶液現配現用;批量配置的抗生素溶液分裝後向冷凍保存,但解凍後的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料,也可由使用者自行測定。



1.瓊脂培養基的融化

將培養基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經過高壓滅菌的培養基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養基融化後立即移開,室溫靜置片刻(約2min),以免玻璃容器發生破裂。


融化後的培養基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫,冷卻到47℃~50℃所需的時間取決於培養基的類型、體積和在水鍋裏的分裝量。融化後內培養基應盡快使用,放置時間一般不超過4h。剩餘的培養基固後不得再次融化使用。特別是靈敏性培養基,應根據相關標準,縮短融化後放置的時間。


將瓊脂培養基倒入類似檢測培養使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄並保存瓊脂的融化溫度。


加入樣品的培養基應將溫度調節到44℃~47℃,或按照相關標準調節溫度。


2.培養基的脫氣

必要時,在使用前將養基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時鬆開容器蓋子;加熱後蓋緊蓋子,並迅速冷卻至使用溫度。


3.添加成分的加入

對熱不穩定的添加成分應在培養基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養基並充分混勻,盡快分裝到待用的容器中。


4.培養基的棄置

所有汙染和未使用的培養基的棄置應采用安全的方式,並符合相關法律法規的規定。


傾注融化後的培養基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養基),或根據相關標準要求製備平皿。將平皿蓋好皿蓋後放置在水平平麵使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養時間超過48h或培養溫度超過40℃,要增加培養基的傾注量。


注:在培養過程中,瓊脂培養基會損失水分,在某些環境條件下會影響微生物的生長。,造成培養基水分損失的因素很多,如培養基的成分、平皿中培養基的量、培養箱的類型(如使用帶風扇的培養箱)、培養箱裏的空氣濕度、平皿在培養箱中放置的位置和數量以及培養溫度等。


凝固後的培養基應立即使用或存放在防止其成分發生變化的條件下,如存放於暗處和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側麵做好標記,標記的內容包括培養基名稱、製備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養基編碼係統進行標記。


將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產生,平板應冷卻後再裝入密封袋中。貯存前不要對培養基表麵進行幹燥處理。


對於采用表麵接種的固體培養基,應先對瓊脂表麵進行幹燥:揭開平皿蓋,將平板倒扣於烘箱/培養箱中(溫度設置為25℃~50℃);或放在有對流風的無菌淨化台中,直到培養基表麵的水滴消失為止。注意不要過度幹燥。商業化的平板脂培養基應按照廠商提供的說明使用。




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